易扩增子 (EasyAmplicon)

英文版见(English Version in) README.md

版本：1.20

更新日期：2023/10/13

简单易学易用、开源、可重复且社区支持的扩增子数据分析流程

第一次使用参考安装段落下载并安装流程及依赖关系。使用RStudio打开EasyAmplicon/pipeline.sh即可逐行完成扩增子分析。

简介 (Introduction)

文件描述:

• Readme.md # 英文版帮助
• Readme_cn.md # 中文版帮助
• pipeline.sh # Windows或Linux版命令行分析流程
• pipeline_mac.sh # MacOS版命令行分析流程
• result/ # 示例结果(正对照)
• result/Diversity.Rmd # 交互式多样性可重复分析代码，可编译为HTML网页或Word文档报告

主要功能：

• 分析和可视化微生物组数据，尤其是16S rDNA扩增子测序
• 从原始数据到特征表的端对端
• 支持20余种分析方法，并生成出版级图表
• 在普通个人电脑上3小完成示例项目
• 中、英文双语帮助文档，中文视频教程支持确保可重复

图1. 易扩增子分析双端扩增子数据的流程

图2. 结果的部分可视化示例

安装(Install)

系统要求 System requirement: Windows 10+ / Mac OS 10.12+ / Ubuntu 20.04+

安装视频教程：https://www.bilibili.com/video/BV1Cb411f7La/

依赖软件环境(Install Dependency)

请安装与你操作系统一致的软件

• R语言环境R 4.x.x，支持R代码运行：https://www.r-project.org/，推荐下载Rtools实现包的源码安装
• R语言开发环境RStudio 2023.xx.x，用于执行流程：https://posit.co/download/rstudio-desktop/
• STAMP v2.1.3 特征表统计和分析图型界面软件 http://kiwi.cs.dal.ca/Software/STAMP
• (可选，仅Windows用户)Git Bash命令行环境的Git for Windows 2.xx.x，支持在Windows系统中运行Shell语言，下载并安装最新版：http://gitforwindows.org/

以最常用的Windows系统(87.5%)为例，你可以快速下载上面的软件安装包：Git for Windows、R、RStudio、STAMP，合集见百度网盘db/win目录。

• (可选，推荐)R包的快速安装

在R语言的统计和可视化中会使用超过500个R包，安装不仅费时费力，而且经常出错或依赖其他编绎工具。为方便大家使用，我们提供了编绎好的R包合集下载，如 Windows版、Mac版。你可以下载解压后，将 4.3 目录移动至 C:\Users\[$UserName]\AppData\Local\R\win-library\中即完成安装。

安装易扩增子 (Install EasyAmplicon)

• 易扩增子流程EasyAmplicon，包括分析流程代码、测序数据和示例结果(分析的正对照)， https://github.com/YongxinLiu/EasyAmplicon
• 易微生物组EasyMicribome，提供易扩增子流程依赖的常用软件、脚本和数据库， https://github.com/YongxinLiu/EasyMicrobiome

下载以上项目至C或D盘，并解压。以下提供三种下载方式可选(让你永远留有后手)

• 方法1. 网页下载。访问项目主页，点击 Code -- Download，选择下载位置，开始下载
• 方法2. git命令行下载。直接生成目录，无需解压。git clone https://github.com/YongxinLiu/EasyAmplicon和git clone https://github.com/YongxinLiu/EasyMicrobiome。 注：提示fatal: unable to access可能只是网络问题，重试或改天重试一般可解决，或找代理或朋友帮忙下载。
• 方法3. 直接从国内百度网盘链接中db/soft目录下载: EasyAmplicon、EasyMicrobiome

(可选)扩展软件和数据库

• Rtools：用于从源码进行R包的安装，windows版本见：https://cran.rstudio.com/bin/windows/Rtools/
• 16S数据库：16S常用RDP/SILVA/GreenGene/EzBioCloud数据库进行物种注释，默认下载了RDP和EzBioCloud。可以从上述数据库官网下载并整理为USEARCH使用的格式，此处推荐从USEARCH官网下载USEARCH兼容格式的数据库。默认流程使用体积小巧的RDP v18训练集数据库 (rdp_16s_v18.fa.gz)，并已保存于EasyMicrobiome/usearch目录中。可选GreenGenes 13.5 (gg_16s_13.5.fa.gz)和SILVA (silva_16s_v123.fa.gz) 数据库，从USEARCH官网根据需要下载并保存于usearch目录中。此外，如果要开展PICRUSt和Bugbase功能预测分析，还需要使用GreenGenes数据库13.5中按97%聚类的OTU序列 (己保存于流程gg目录中97_otus.fasta.gz)。该数据源于GreenGenes官方，解压后选择其中的97_otus.fasta保存于gg目录下
• ITS数据库：研究真菌或真核生物采用转录间隔区 (Intergenic Transcribed Spacer) 测序，需要使用UNITE数据库，目前最新版已经保存于EasyMicrobiome\usearch目录。如流程中数据库没有及时更新，可在UNITE官网 (https://unite.ut.ee/) 下载适合USEARCH的最新版注释数据库。官方数据库存在格式问题，详细常见pipeline.sh中附录常用问题

快速运行(Quick Start)

使用视频教程：https://www.bilibili.com/video/BV1is4y157Ms/

1. 准确输入数据：典型的扩增子测序起始文件包括测序数据和元数据两类。

测序数据(*.fq.gz)为seq/目录中的成对fastq/fq文件，通常采用.gz的压缩格式保存节省空间。元数据(metadata.txt)为按样本编号对应的分组、时间、地点等描述信息。EasyAmplicon项目中有准备好的demo数据用于测试分析流程是否可以正常工作(正对照)，同时提供标准格式的参考模板，指导用户准备标准的输入数据。

新项目在准备好测序数据和元数据后，复制EasyAmplicon中的pipeline.sh至新项目文件夹。然后用RStudio打开pipeline.sh即可开始分析之旅。

2. 开始分析流程

参考Pipeline.sh中的代码，按说明设置工作目录(work directory)、脚本和数据库(EasyMicrobiome)位置等，在RStudio中逐行或逐段选择代码并运行(Run)即可完成整套分析流程。

主要数据分析步骤如下： - 合并双端序列并按样品重命名 - 引物切除和质量控制

• 序列去冗余并挑选代表序列 - 特征表生成和筛选 - Alpha多样性计算 - Beta多样性计算 - 物种注释分类汇总 - 有参分析和功能预测 - 空间清理及数据提交 - STAMP和LEfSe软件输入文件准备

每步骤参数和结果的详细解读，详见 《易扩增子：易用、可重复和跨平台的扩增子分析流程》https://bio-protocol.org/bio101/e2003641

常见问题 (FAQ)

pipeline.sh 中的常见问题 注：.sh脚本全部为markdown格式，使用有道Note或VSCode，阅读体验更佳。

更新日志 (Change log)

2023/3/11 1.18.1 解决备用下载链接失效问题？视频转移到B站链接，下载文件提供百度云链接。

2023/6/4 1.19 R和Rtools更新为4.3，RStudio更新为2023.03.1

引文 (Citation)

使用此脚本，请引用下文：

Yong-Xin Liu, Lei Chen, Tengfei Ma, Xiaofang Li, Maosheng Zheng, Xin Zhou, Liang Chen, Xubo Qian, Jiao Xi, Hongye Lu, Huiluo Cao, Xiaoya Ma, Bian Bian, Pengfan Zhang, Jiqiu Wu, Ren-You Gan, Baolei Jia, Linyang Sun, Zhicheng Ju, Yunyun Gao, Tao Wen, Tong Chen. 2023. EasyAmplicon: An easy-to-use, open-source, reproducible, and community-based pipeline for amplicon data analysis in microbiome research. iMeta 2: e83. https://doi.org/10.1002/imt2.83

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